pcr

به وب سايت آموزش زيست شناسی خوش آمديد

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

مقدمه و تاریخچه PCR

سه کشف مهم در دهها های 70 و 80 میلادی، امکان جدا سازی ژن و خواندن رمزهای ژنتیکی را فراهم کرد. این سه کشف عبارت بودند از:

مهندسی ژنتیک، تعین توالی DNA و توانایی تکثیرDNA. اندکی پس از کشف این تکنیک، دانش و شناخت ما از ژنتیک و بویژه ژنتیک مولکولی چندین برابر شد و سرعت پیشرفت پژوهش های علوم زیستی شدت گرفت. این یکی از توانایی های ویژه ماست که امروزه می توانیم هر ژنی را و از هر موجودی به سرعت تکثیر کنیم، توالی آن را شناسایی کنیم و یا حتی تغییر دهیم.
برای اولین بار KHorana و همکارانش با کمک قطعاتی از پرایمر موفق به همانند سازی DNA در محیط خارج از سلول شد. اما این اندیشه که اگر این عمل بارها و بارها به صورت چرخه ای تکرار شود، می تواند میلیونها کپی از DNA تهیه کند، حدود 12 سال بعد و توسط کری مولیس (Kary Mullis) در مجله ScientificAmerican مطرح شد. مولیس در سال 1983 اولین آزمایشات عملی در مورد PCR را در شرکت Cetus انجام داد و اولین مقاله را در مورد چگونگی انجام PCR با استفاده از قطعه کلینواز DNA پلی مراز I منتشر کرد و به ای ترتیب به دلیل این کشف مهم، جایزه نوبل سال 1993 را به خود اختصاص داد.
PCR تکثیر یا همانند سازی DNA در فضای خارج از سلول (Invitro) است. این در حالی است که تمام مواد مورد نیاز برای همانند سازی یا همان PCR، موادی هستند که به شکل طبیعی هم برای همانند سازی درون سلولیDNA مورد نیاز است.
اگر چه به نظر می رسد که باز شدن دو رشته DNA از یکدیگر و الگو قرار گرفتن آنها برای ساخت رشته های جدید کار ساده ای است. اما همانند سازی DNA در درون یک سلول زنده به کمک فرایندهای گوناگون و پیچیده سلولی انجام می گیرد.
PCR Protocol:

در واكنش زنجیره ای پلی مراز تكثیرمولكول DNA در شرایط آزمایشگاهی و درون لوله به طور آنزیماتیك انجام می گیرد تا تولید قطعات مشخصی از DNA به حدی باشد تا بتوان آنها را با روشهایی مثل الكتروفورز روی ژل آشكار نمود. تكنیك PCR برگرفته از همانندسازی DNA داخل سلول است و از اصول همانند سازی DNAداخل سلول تقلید می شود. این تكنیك شامل سیكلهای تكرار شده ای است كه به كمك یك سری پرایمر و با حضور آنزیم پلی مراز واكنش پلی مریزاسیون را از روی یك DNA الگو انجام می دهد.

حد اقل عوامل مورد نیاز برای یك واكنش PCR:

1-                  DNA یا RNA الگو.

2-                  پرایمرها .

3-                  DNTPها .

4-                  آنزیم Taq   پلیمراز.

5-                  وجود شرایط بافری مناسب و یون Mg²⁺.

1- DNA یا RNA الگو:

الگو DNA یا RNA تك رشته ای و یا دو رشته ای است. اگر الگو RNA باشد می توان از RNA پلی A برای سنتز cDNA قبل از PCR استفاده نمود. PCR قادر است حتی یك مولكول تك را در مقادیر حتی نانو گرم از DNA تكثیر نماید. با این وجود در عمل باید تعداد بیشتری از مولكول هدف موجود باشد تا جوابهای مناسب و ایده آل بدست آید.

2- پرایمرها :

پرایمرها برای مكمل بودن به طور دقیق از روی DNA الگو طراحی می شوند. طول پرایمر به طور معمول 20 تا 30 نوكلئوتید است. استفاده از پرایمر بزرگتر از 30 نوكلئوتید موجب افزایش اختصاصی تر شدن پرایمر نمیشود. از طرفی طول پرایمر روی سرعت اتصال آن به رشته الگو اثر می گذارد. پرایمر بلندتر زمان بیشتری برای هیبریداسیون نیاز دارد. در پرایمر مناطق غنی از پلی پورین و پلی پیریمیدین یا موتیف های تكراری نباید باشند. سكانس پرایمر نباید ایجاد ساختار ثانویه كند. پرایمرها نباید مكمل یكدیگر باشند. به خصوص در ناحیه 3' دایمر پرایمر تشكیل نشود. فاصله بین پرایمر ها معمولا كمتر از 10 كیلو جفت باز است. تكثیر قطعات بیش از 3Kb مشكل و سبب كاهش بازده سنتز می شود. پرایمر باید بسیار اختصاصی باشد و تنها به سكانس ویژه ای رو ی DNA الگو بچسبد. ضمن این كه كمترین هیبریداسیون را با دیگر سكانسهای موجود در نمونه داشته باشد. دو پرایمر باید طوری طراحی شوند كه TM آنها نزدیك به هم باشد. پرایمر معمولا با یك یا دو باز پورین شروع و خاتمه می یابد.

3- dNTPها:

یك PCR به طور طبیعی با غلظت حدود 100µM از dNTPها انجام می شود. در غلظت های پایینتر یعنی 10 تا 100 میكرومول از dNTP ها آنزیم Taq دارای عملكرد مناسب تری است, با این وجود غلظت بهینه dNTPها بستگی به موارد زیر دارد:

الف: غلظت MgCl2.

ب: غلظت پرایمر.

ج: طول محصول.

د: تعداد سیكلهای PCR.

همانطور كه در سنتز طبیعی DNA چهار نوع نوكلئوتید مورد استفاده قرار می گیرد در واكنش PCR نیز چهار نوع توكلئوتید به فرم دی اكسی مورد نیاز است.

4- Taq پلیمراز:

آنزیم مقاوم به حرارت است ودمای 70 تا 80 بهترین درجه برای پلیمریزاسیون است كه قادر است 35 تا100 نوكلئوتید در ثانیه پلیمریزه كند. این آنزیم با شناسایی انتهای آزاد هیدروكسیل در 3' پرایمر نوكلئوتید ها را به ترتیب ارائه شده از روی زنجیره مكمل به آن متصل می نماید و رشته DNA مكمل رشته الگو می سازد. این آنزیم دارای فعالیت اگزونوكلئازی 5' به 3' می باشد.

5- بافرها وMgCl2:

به طور معمول بافر به شكل 10X ارائه می گردد و عبارت است از:Tris-HCl, KCl, MgCl2 و ژلاتین. غلظت نهایی MgCl2 در مخلوط واكنش می تواند متغیر باشد. غلظت 1 تا 5/1 میكرومول از MgCl2 یك غلظت بهینه است. Mg²⁺ با dNTPها كمپلكس محلولی تشكیل می دهد كه برای ورود آنها به DNA در حال ساخت وساختارآنزیم ضروری است. از طرفی فعالیت پلیمرازی را تحریك می كند و آنزیم برای فعالیت نیاز به یون Mg²⁺ دارد. دمای ذوب TM را افزایش می دهدو جدا سازی دو رشته الگو ونیز محصول PCRبا تأخیر انجام می شود. پس زمان مرحله دناتوره شدن را باید بیشتر در نظر گرفت.

با افزایش Mg²⁺ قدرت اتصال پرایمرها افزایش می یابد و باعث اتصال پرایمرها به سكانس هدف می شوند ولی از طرفی سبب اتصال غیر اختصاصی آنها نیز می شود. به همین دلیل مقدار كم Mg²⁺ منجر به محصول كم و مقدار اضافی آن منجر به جمع شدن محصول غیر اختصاصی می گردد.

عواملی كه موجب كاهش بازده PCR می شوند:

1-     كاهش میزان آنزیم بعد از 25 تا 30 سیكل.

2-     كاهش فعالیت آنزیم در اثر Denaturation حرارتی مرحله به مرحله.

3-     اتصال مجدد رشته های هدف و كاهش غلظت آن و عدم اتصال پرایمر.

4-     غلظت یون Mg²⁺^.

5-     پروفایل حرارتی ( چرخه نا مناسب دمایی)PCR.

مكانیسم PCR:

واسرشت اولیه: (First Denaturation)

در این مرحله دو رشته های DNA به طور كامل از هم باز می شوند. این دما معمولا 95 درجه و برای مدت 2:30 تا 5 دقیقه در نظر گرفته می شود.

مرحله واسرشت: ( Denaturation)

این مرحله یكی از مراحل 35 سیكل چرخه PCR است. معمولا 94 درجه و به مدت 1 دقیقه اعمال می گردد. در این مرحله دو رشته های الگو كه شامل DNA اولیه و محصولات قبلی است از یكدیگر باز شده و تك رشته ها آماده پذیرش پرایمر میگردند.

مرحله اتصال DNA به رشته هدف: (Annealing )

با كاهش دما دو رشته DNA تمایل به نزدیك شدن به یكدیگر و تشكیل پیوندهای هیدروژنی دارند(Self Assembly). اما در این بین به دلیل كوچك بودن پرایمرها و تحرك بیشتر آنها استعداد اتصال پرایمرها به بخشهای مكمل در تك رشته ها بیشتر از رشته كامل DNA است. با تعیین دمای مناسب برای اتصال اختصاصی پرایمرها به رشته الگو, از اتصالهای غیر اختصاصی جلوگیری می شود. همانطور كه عنوان شد تعیین دمای مناسب اتصال پرایمر به رشته الگو یكی از مراحل كلیدی اپتیمایز كردن PCR است كه با كمك این فرمول محاسبه می شود :                                                         Ta= 4(C+G) +2(A+T)-5

این فرمول برای پرایمرهای بزرگتر از 20 نوكلئوتید دقیق و صحیح نمیباشد.

این مرحله بسیار حساس و مهم است. اگر دما بالاتر باشد رشته ها هیبرید نمی شوند و جدا می مانند و اگر دما پایینتر باشد رشته هایی كه اشتباه وصل شده اند پایدار می مانند. این دما باید به اندازه ای باشد كه هم هیبریداسیون پرایمر و الگو انجام شود و هم از طرف دیگر از هیبرید شدن اشتباه جلوگیری شود.

مرحله پلیمریزاسیون:   (Extension )

بعد از اتصال پرایمرها دمای محیط بالا میرود. این دما در 72 درجه كه دمای اپتیموم فعالیت Taq پلیمراز است ثابت می شود. مدت زمان پلیمریزاسیون متغیر است و به طول قطعه مورد نظر بستگی دارد. هر چه طول قطعه بیشتر باشد, زمان Extension را هم بیشتر در نظر می گیرند. زمان زیاد برای قطعات كوتاه, در پلیمریزاسیون احتمالی مناطق غیر اختصاصی بی تأثیر نیست. . افزایش سیكل باعث افزایش سكانس هدف به شكل تصاعدی می گردد. در سیكل اول اندازه محصول بزرگتر است و آنزیم از سكانس هدف جلوتر می رود ولی در سیكلهای بعدی فقط سكانس هدف آمپلی فای می شود . زمان پلیمریزاسیون متناسب با طول هدف مورد تكثیر است و لی از 2 دقیقه تجاوز نمیكند. در سیكل آخر معمولا حدود 10 دقیقه استفاده می شود. افزایش سیكلها موجب افزایش محصولات غیر اختصاصی و عدم افزایش محصول اختصاصی می شود.

مرحله پلیمریزاسیون نهایی: (Final Extension)

در این مرحله كه حدود 10 دقیقه برای آن وقت در نظر گرفته می شود, تمامی قطعات ناقص به طور كامل پلیمریزه شده و تشكیل فراگمنتهای كامل را می دهند. دما در این مرحله هم 72 درجه در نظر گرفته می شود.

آلودگیPCR:

به دلیل حساسیت فوق العاده واكنش پلیمراز, هر قطعه DNA خارجی كه وارد محیط PCRشود مورد تكثیر قرار گرفته و نتایج دور از واقعیت شكل می گیرد. حساسیت این روش ایجاب می كند كه مراقبت شدیدی اعمال گردد تا به این وسیله از تكثیر آلوده كننده هایی مانند DNA های تكثیر شده از آزمایشهای قبل جلوگیری به عمل آید.

علل تشكیل محصولات غیر اختصاصی:

الف: علل ناشی از تركیبات:

1-     غلظت بالای پرایمر.

2-     دژنره بودن بالای پرایمرها.

3-     اتصال پرایمر به سكانسهای غیر اختصاصی.

4-     پایین بودن خاصیت دناتوره شدن رشته های هدف.

5-     غلظت بالای یون منیزیوم.

6-     غلظت بالای dNTP ها.

7-     غلظت بالای آنزیم Taq.

8-     اپتیمایز نبودن PH بافر.

ب: علل ناشی از شرایط برنامه:

1-     پایین بودن دمای آنلینگ.

2-     بالا بودن تعداد سیكلها.

3-     بالا بودن مدت زمان هر سیكل( زمان Extension).

4-     وجود محدود كننده های واكنش.

5-     آلودگی به هر شكل ممكن.

كاهش غلظت یا عدم وجود محصول:

الف: علل ناشی از تركیبات:

1-     پایین بودن غلظت پرایمر.

2-     بالانس نبودن میزان پرایمرها.

3-     میزان نا مناسب محصول اولیه برای واكنش Nested PCR.

4-     پایین بودن غلظت میزان الگو.

5-     بالا بودن غلظت الگو.

6-     دژنره شدن الگو.

7-     DNA الگو شامل سكانس هدف نباشد.

8-     پایین بودن غلظت Mg²⁺.

9-     پایین بودن غلظت dNTP.

10- تخریب dNTP.

11- بالا بودن PH بافر.

12- كافی نبودن میزان Mix PCR .

13- همگن نبودن بافر و سایر تركیبات.

ب: علل ناشی از شرایط واكنش:

1-     بالا بودن دمای Denaturation.

2-     بالا بودن دمای Annealing

3-     اپتیمایز نبودن زمان Extension.

4-     وجود مهار كننده های واكنش.

5-     آلوده بودن تیوبهای واكنش.

6-     كم بودن تعداد سیكلها.

7-     مشكلات ناشی از دستگاه ترموسایكلر.

مشاهده باندهای و یا اسمیر سنگینتر از محصول مد نظر:

الف: علل ناشی از تركیبات:

1-     بالا بودن غلظت پرایمر.

2-     همولوژی بین ناحیه مدنظر برای PCR با مناطق دیگر در ژنوم.

3-     خراب شدن رشته الگو و یا غلظت بالای DNAژنومیك.

4-     غلظت بالای یون منیزیوم.

5-     غلظت بالای آنزیم.

ب: علل ناشی از شرایط واكنش:

1-     پایین بودن میزان Denaturation رشته الگو.

2-     پایین بودن حرارت ِAnnealing.

3-     بالا بودن زمان ِAnnealing

4-     بالا بودن زمان Extension.

5-     نیاز به برنامه Tawch Down.

6-     بالا بودن تعداد سیكلها.

7-     آلودگی با DNA یا RNA دیگر.

مشاهده پرایمر دایمرها:

الف: علل ناشی از تركیبات:

1-     مكمل بودن انتهای 3' پرایمرها.

2-     نیاز به پرایمرهای بلند تر.

3-     بالا بودن غلظت پرایمر.

4-     پایین بودن غلظت رشته الگو.

ب: علل ناشی از شرایط واكنش:

1-     اپتیمایز نبودن دمای Annealing.

2-     بالا بودن تعداد سیكلها.

3-     مشابه بودن توالی پرایمرها با سكانسهای تكراری DNA الگو.

4-     نزدیك بودن طول قطعه با سایز پرایمرها.

هر كدام از مواد بر جای مانده ضمن استخراج از جمله فنل, كلروفورم, دترجنتها, هپارین, اینوزین, و حتی EDTA می توانند به عنوان یك محدود كننده واكنش پلیمراز باشند. در این شرایط لازم است كه DNA را كلین كرد و واكنش را تكرار نمود.

موادی مثل DMSO ( با عوض كردن TM مربوط به هیبریداسیون پرایمر ورشته هدف), گلیسرول, BSA, فرمامید, PEG و اسپرمیدین می توانند به عنوان تشدید كننده واكنش عمل كنند.

راه های جلوگیری از آلودگی در واكنش پلیمریزاسیون:

الف: آلودگی ناشی از مواد:

1-     جدا كردن قطعات اضافی DNA در صورتی كه PCR بعد از RFLP انجام می گیرد.(DNA cleanning)

2-     جدا كردن DNA پلازمیدی كه شامل سكانسهای الگو می باشند.

3-     آلودگی های بعد از PCR به سبب Handling نادرست .

ب: آلودگی های ناشی از شرایط محیطی:

1-     آلوده شدن سمپلها با نمونه های بیولوژیكی دیگر در محیط.

2-     روشهای نا مناسب سمپلینگ و هندلینگ.

3-     همكاران آزمایشگاهی.

4-     آلوده بودن محیط آزمایشگاهی و كلیه دستگهای مرتبط.

5-     هموژنایزربافتی الوده.

6-     آلوده بودن دستكش ها.

7-     آلودكی پیپت و نوك سمپلرها و ویالها.

خطاهای فردی و تكنیكی یكی دیگر از عوامل مخاطره انگیز PCR می باشد.

تجزیه و تحلیل محصول PCR:

1-     مشخص شدن ترادف DNA الگو و تغیرات آن.

2-     مقدار محصول تكثیر شده كه نشان دهنده مقادیر نسبی الگوی اولیه است.

3-     تجزیه و تحلیل ترادف به وسیله تعیین ترادف محصول و یا هیبریداسیون با پروبها.

محصول PCR به طور معمول كوچكتر از 10Kbp است. روش معمول برای دیدن آن الكتروفورز روی ژل و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید است.

بازگشت به صفحه تکنیک های آزمایشگاهی

امانت داری و اخلاق مداری: استفاده از این منابع با ذکر منبع زیست شناسی غضنفری بلامانع می باشد.